Иммуноанализ что это такое


Как проводится и что показывает иммуноферментный анализ

Современная диагностика в медицине немыслима без высокочувствительных лабораторных анализов. Прежде для установления причин тех или иных симптомов врачи были вынуждены ориентироваться на косвенные признаки болезни, а также проводить многоступенчатые микроскопические исследования в попытке обнаружить возбудителя инфекции. Сегодня достаточно одного-единственного теста — такого как иммуноферментный анализ — чтобы подтвердить или опровергнуть первоначальный диагноз.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод лабораторной диагностики, основанный на реакции «антиген-антитело», который позволяет выявить вещества белковой природы (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей).

Чтобы понять, как устроен иммуноферментный анализ, попробуем разобраться в сути реакции «антиген-антитело». Антиген — это чужеродная для организма молекула, как правило, белкового происхождения, которая может попасть в тело человека вместе с инфекционным агентом. Частицы чужой крови (если она не совпадает с нашей по группе) также являются антигенами. В организме антигены способны вызывать иммунную реакцию, направленную на защиту целостности внутренней среды от чужеродных веществ. Поэтому наше тело синтезирует особые вещества — антитела (иммуноглобулины), способные по принципу «ключ к замку» соединяться с антигенами, связывая их в иммунный комплекс (этот процесс как раз называется реакцией «антиген-антитело»). Такие иммунные комплексы легче распознаются и уничтожаются клетками иммунитета.

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Также существуют иммуноглобулины класса А (они в большом количестве содержатся в слизистых оболочках, защищая «подступы» к организму), Е (борются с паразитарными инфекциями) и другие. В лабораторной диагностике объектами интереса чаще всего являются IgM, IgG и IgA: по их концентрации можно оценить, на какой стадии находится инфекционный процесс, а также узнать, болел ли когда-либо человек тем или иным недугом (например, краснухой или ветряной оспой).

Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

Реакцию «антиген-антитело» можно воспроизвести в лабораторных условиях: использовать уже готовые антитела или антигены, чтобы определить, есть ли в исследуемом образце соответствующее им соединение.

Для начала необходимо получить образец биологической жидкости — обычно, это сыворотка крови. Лаборатория использует пластиковые планшеты с лунками, в которых уже содержатся очищенные антигены предполагаемого возбудителя (или — антитела, в случае если задачей является поиск антигена). Образцы вносятся в лунки, где происходит — или не происходит — образование иммунных комплексов. Если «встреча» состоялась, особое красящее вещество вступает в ферментную реакцию с объединенной молекулой, что позволяет с помощью инструментальной оценки оптической плотности сделать выводе о результатах анализа.

ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Это интересно Предшественником иммуноферментного анализа был радиоиммунный анализ, в котором для идентификации успешной реакции использовались меченые антитела и антигены. Поскольку проведение такой диагностики представляло потенциальную угрозу для здоровья сотрудников лаборатории, ученые озаботились поиском безопасной альтернативы по «окраске» образцов. Так в 1971 году был изобретен ИФА.

Преимущества метода

Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

ИФА во многом заменил «золотой стандарт» микробиологии — бактериологический метод диагностики, в ходе которого для идентификации возбудителя требовалось выделить его из организма, а затем в течение нескольких дней выращивать культуру на питательной среде в пробирке. Все то время, пока производился анализ, врачи были вынуждены лечить пациента «вслепую», догадываясь о происхождении микроорганизма по симптомам болезни. Определение IgM с помощью ИФА позволяет поставить точный диагноз уже в первые дни болезни.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

Недостатки метода

К сожалению, для проведения ИФА нужно знать, что именно искать: методика анализа подразумевает, что врач заранее имеет предположение о природе заболевания. Поэтому нет смысла назначать такой тест в надежде случайно «угадать» диагноз.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Показания к назначению и выявляемые заболевания

Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

  1. Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
    • IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
    • IgG к ВИЧ;
    • Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
    • Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
    • Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
    • Ig M и IgG к токсоплазмозу;
    • Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
    • IgG к паразитарным заболеваниям;
    • Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
    • IgG к хеликобактерной инфекции.
  2. Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
  3. Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
  4. Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

Анализируемый биоматериал и особенности его забора

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

Сроки готовности результатов ИФА

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

Расшифровка иммуноферментного анализа

Результатом качественного ИФА будет однозначный вердикт: искомое вещество либо найдено, либо не найдено в образце. Если же речь о количественном анализе, то концентрация может выражаться числовым значением или определенным количеством знаков «+» (от одного до нескольких).

Анализируемые показатели
  • IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
  • IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
  • IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
  • IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.
Возможные результаты ИФА

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

www.kp.ru

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа — непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)

Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

I. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Раститровка специфичных антител

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.

При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител — в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.

Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М h3SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.

Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)

Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп — антитело подложки, АТд — детекторное антитело, АГ — антиген, М — метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П — подложка, на которую сорбируется антитело подложки.

В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

I. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

VI. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М h3SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VII. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Версия для печати

www.bialexa.ru

Б. Иммуноанализ

Иммуноанализ — это полуколичественный метод определения содержания веществ, присутствующих в очень низких концентрациях. В принципе иммуноанализом можно определять любые соединения, вызывающие образование антител.

Основой этого метода является «реакция» антиген-антитело, то есть специфическое связывание антитела с определяемым веществом. Из многих разработанных методов иммуноанализа, таких, как радиоиммунный анализ (РИА), хемилюминесцентный иммуноанализ и так далее, здесь рассматривается вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

Образцы сыворотки крови, содержащие определяемое вещество, к примеру гормон тироксин, помещаются в лунки планшета для микротитрования (1), на стенках которых сорбированы антитела, способные специфически связывать гормон. Одновременно в инкубационную смесь вносится небольшое количество тироксина, химически связанного с ферментом, так называемый конъюгат (1). Конъюгат и определяемый гормон конкурируют между собой за связывание с ограниченным количеством сорбированных антител. После того как связывание антигенов произошло (2), несвязавшиеся молекулы отмывают. Для определения количества связавшегося конъюгированного антигена в лунки вносят раствор хромогенного субстрата (субстратный буфер) и окрашенные продукты ферментативной реакции (3) определяют фотометрически (4) (см. Ферментативный анализ).

Чем большее количество конъюгата свяжется с антителами, сорбированными на стенках лунки микропланшета, тем выше содержание окрашенного продукта ферментативной реакции. В то же время, чем больше гормона в тестируемой пробе, тем меньше конъюгата будет связываться с антителами. Количественная оценка осуществляется с помощью градуировочной кривой, которую строят по стандартным образцам с известной концентрацией, проводя несколько параллельных измерений.

Статьи раздела «Моноклональные антитела, иммуноанализ»:

  • А. Моноклональные антитела
  • Б. Иммуноанализ

— Следущая статья   |   — Вернуться в раздел

Page 2

Гормоны: — виды рецепторов, — аденилатциклаза, — фосфолипаза С, — гуанилатциклаза, — цитозольный механизм, — иерархия гормонов, — роль гипоталамуса, — соматотропный гормон, — проопиомеланокортин, — вазопрессин, — гормоны обмена кальция, — тиреоидной функции, — поджелудочной железы, — катехоламины, — кортикоидной функции, — минералокортикоиды, — репродуктивной системы.

www.drau.ru

Глава 4 Иммуноанализы

Термин «иммуноанализ» в международной литературе применяют не к любым методам исследований, используемым в иммунологии, а только к тем, в которых ключевыми взаимодействующими субстанциями являются исходно растворимые «антиген» (или лиганд) и «антитело». В более чем 99% современных тест-систем иммуноанализов один из компонентов (либо антиген, либо антитело) сорбирован на твердой фазе, но сорбированы они из исходно растворимого состояния.

Область применения иммуноанализов широка, но чаще их используют с диагностическими целями практически во всех отраслях медицины, а также в ветеринарии и биологии. Нередко иммуноанализы находят совершенно необычное применение. Например, итальянские виноделы для осветления вина марки «мерло» используют пшеничную муку. Полученный винный продукт может содержать пшеничный глютен, опасный для больных целиакией. Иммуноанализы позволяют выявить присутствие глютена и забраковать такое вино.

В 20-30 гг. ХХ века (после работ Ф. Обермейера, Е.П. Пика, К. Ландштейнера и других ученых, получавших антитела к искусственно синтезированным антигенам) к антителам стали относиться как к высокоспецифическим реагентам, избирательно связывающим то или иное вещество, способное быть антигеном при иммунизации животных.

Чтобы лучше понять суть методов иммуноанализов, полезно осознать их отличие от иных исследований, применяемых в современной иммунологии. В фундаментальных исследованиях по иммунологии используют фактически все известные в биологических науках методы. Самые современные - методы молекулярной биологии и молекулярной генетики. В прикладной клинической иммунологии методическая база не столь широка. По сути иммунологическими называют такие методы, в которых так или иначе визуализируются реакции «антиген-антитело».

Антитела - растворимые молекулы белков. Антигены бывают разные (корпускулярные, растворимые, нерастворимые), но далеко не все видны невооруженным глазом (как, например, эритроциты в реакциях

гемолиза или агглютинации). Связывание двух растворимых молекул часто приводит к образованию также растворимого иммунного комплекса, следовательно, невидимого глазом. Поэтому с технической стороны разные тест-системы иммуноанализа различаются между собой средствами визуализации факта связывания антитела с антигеном. С 1948 г. и до конца 1960-х гг. методы визуализации комплексов антиген-антитело представляли собой преципитацию в геле (методы Оухтерлони, Манчини, варианты иммуноэлектрофореза в геле), т.е. выпадение этих комплексов в осадок, а также гемолиз или гемагглютинацию с использованием хорошо видимых эритроцитов, на поверхность которых сорбировали либо антиген, либо (реже) антитела.

4.1. Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле

Встречная иммунодиффузия по Оухтерлони и Элеку

В 1948 г. Орьян Оухтерлони (Orjan Ouchterlony) и независимо от него Стефан Элек (Stephen Elek) опубликовали разработанную ими методику двойной, или встречной, иммунодиффузии, т.е. диффузии антител и антигенов навстречу друг другу в геле. Эти исследователи обнаружили и использовали физико-химические свойства агарового геля, поры которого имеют размеры, достаточные, чтобы пропустить (дать возможность диффундировать) молекулы свободных антител и многих растворимых антигенов, но задерживающие более крупные по размеру комплексы антител с антигенами. В результате в месте встречи антител с антигенами выпадает осадок; в геле он виден невооруженным глазом как полоса преципитации. Оухтерлони и Элек подобрали концентрацию агар-агара - 1,25-1,5%.

Порядок постановки реакции следующий.

1. Агар растворяют в физиологическом растворе при 56 °С (температура расплавления агара).

2. В виде золя агар выливают на плоское стекло. При охлаждении до комнатной температуры агар застывает в гель.

3. В застывшем геле пробивают трубочкой-пробойником правильные круглые отверстия (лунки) небольшого диаметра (~2-3 мм).

4. В эти лунки вносят образцы антисыворотки и растворы антигенов.

5. Оставляют на диффузию в течение 16-24 ч, по истечении которых можно наблюдать полосы преципитации, если в исследуемых образцах присутствовали комплементарные друг другу лиганды.

Метод Оухтерлони и Элека иллюстрирует рис. 4.1. (см. также цв. вклейку).

Рис. 4.1. Метод Оухтерлони и Элека: а - линии преципитации, при диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ), плавно сливающиеся друг с другом; б - линии преципитации, при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам, не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие» друг друга

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них - Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М.

Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было.

Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.

По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы - препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) - позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории.

Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов.

Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл).

Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа - ИФА (см. ниже):

1) общий IgE - ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела;

2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.

IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом).

В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра).

Таблица 4.1. Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме

Окончание табл. 4.1

Таблица 4.2. Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме

Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах - МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE.

Лабораторная работа 4-1

Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии

1. Готовят 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера.

2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки,

быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы).

3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.

4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1,5 см.

5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях.

6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки.

7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах.

8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз.

9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды).

Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают.

Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).

Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая

Иммуноэлектрофорез

В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч

для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов).

Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант.

Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а - схема установки; б - результаты электрофореза

В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты - ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4.

Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 - пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 - калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 - пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь)

В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения.

studfiles.net

Методы иммуноанализа, основанные на применении

Д. А. ЧЕРНОШЕЙ, Т. А. КАНАШКОВА

Минск 2007

Меченых компонентов

Список сокращений

ИА

- иммуноанализ

РИА

- радиоиммунный анализ

PACT

- радиоаллергосорбентный тест

ИФА

- иммуноферментный анализ

ТИФА

- твердофазный иммуноферментный анализ

ELISA

- enzyme linked immunosorbent assay

ЭС, ELIspot

- элиспот,enzyme linked immunospot

ИБ

- иммуноблот (вестернблот)

SDS

- sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия

ИГХ

- иммуногистохимия

EMIT

- иммуноанализ с измерением активности фермента {enzyme

monitored immunoassay technique)

ФИА

- флуоресцентный иммуноанализ

РИФ

- реакция иммунофлуоресценции

ФИТЦ

- флуоресцеина изотиоцианат

ФЭ

- фикоэритрин

ИКК

- иммунокомпетентные клетки

CD

- cluster of definition

Th,,2,3

- Т-хелперы 1,2 и 3-го типов

ФИА ВР

- флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением

ЛИА

- люминесцентный иммуноанализ

ЛИКА

- люминесцентный иммунокофакторный анализ

ЛИФА

- люминесцентный иммуноферментный анализ

ХИА

- хемолюминесцентный иммуноанализ

ХИФА

- хемолюминесцентный иммуноферментный анализ

ХИСА

- хемолюминесцентный иммуносубстратный анализ

АТФ

- аденозин-3-фосфат

NAD

- никотинамид-адениндинуклеотид

ЭХИА

- электрохемолюминесцентный анализ

ИС

- иммуносенсор

мэ

- микроэррей

IgE

- иммуноглобулин класса Е

ИХА

- иммунохроматографический анализ

3)упрощение и ускорение анализа:

  • отказ от конкурентного анализа в пользу неконкурентного;

  • отказ от радиоизотопных меток в пользу ферментных или флуо­ресцентных (хемолюминесцентных);

  • создание ускоренных методов иммуноанализа, не требующих спе­циального оборудования и навыков (иммунохроматография (ИХА), дот-ИФА, и др.);

  • создание наборов для одновременного исследования нескольких параметров;

4)миниатюризация анализа:

  • уменьшение размеров устройств;

  • сокращение количества образца, необходимого для анализа;

  • сокращение количества реагентов, необходимых для анализа.

1. Методы иммуноанализа с применением радиоактивной метки

1.1. Радиоиммунный анализ (риа)

РИА был разработан в 50-х гг. прошлого века R. S. Yalow и S. А. Вег-son (определение инсулина). РИА (схема 1) основан на конкуренции опре­деляемого антигена из клинического материала с определенным количест­вом идентичного, меченного изотопом, антигена с ограниченным количе­ством антител.

Схема I. Радиоиммунный анализ (схемы РИА, ИРМА и тИФА созданы по мотивам

рисунков, опубликованных на сайте Томского медицинского университета

http: //biotech. city. tomsk. net)

6

Связанные антигены отделяются от свободных добавлением антигло-булиновой сыворотки, белка А стафилококков или микробус, меченных антителами к иммуноглобулинам, и центрифугированием. Супернатанты отбрасываются, а остаточная радиоактивность измеряется на гамма-счетчике. При указанной схеме постановки радиоактивность обратно про­порциональна содержанию антигена в образце.

Таким образом, РИА является конкурентным гетерогенным методом исследования. Основные его преимущества — высокая чувствительность и специфичность. Применение изотопной метки и мечение антигена обеспе­чивают высокий уровень соотношения сигнал/шум и низкое неспецифиче­ское связывание метки.

Разработан также твердофазный РИА (разделение связавшихся и сво­бодных антигенов достигается простой промывкой флаконов/планшетов).

1.2. ИММУНОРАДИОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (ИРМА)

Определение антител с помощью изотопной метки получило название иммунорадиометрического анализа. В качестве примера ИРМА рассмот­римрадиоаллергосорбеитный тест (PACT).

PACT (схема 2) был разработан в начале 1970-х (L. Wide) для опреде­ления аллерген-специфических IgE в сыворотке крови. Аллерген сорбиро­вали на пористом носителе (бумага, полимерные мембраны, гранулы, губ­ки). Далее добавляли сыворотку пациента, инкубировали 3 ч, отмывали и добавляли антиглобулиновую сыворотку (против IgE), меченную радиоак­тивным изотопом. После отмывки несвязавшихся реагентов, радиоактив­ность учитывали на счетчике.

Первые тесты характеризовались низкой чувствительностью, плохо коррелировали с клиникой и другими аллергологическими тестами (прик-тесты) и не нашли широкого применения. В конце 70-х были предложены PACT второго поколения (большая чувствительность за счет меньшей спе­цифичности и большей продолжительности теста; тесты по-прежнему но­сили качественный характер). Наконец, в 80-90-х гг. распространилисьPACT третьего поколения (большая чувствительность и специфичность за счет применения моноклональных антител против IgE, автоматизации, ис­пользования флуорохромных, ферментных меток или электрохемолюми-нисценции; применение IgE стандартов ВОЗ позволило получать количе­ственные результаты).

В целом, применение изотопных меток (РИА, ИРМА) сыграло важ­ную роль в становлении иммуноанализа. Именно эти методы впервые рас­крыли потенциал иммуноанализа и дали толчок к его разработке и ком­мерческому применению. Тем не менее, недостатки данного подхода (в первую очередь, небезопасность, трудности разработки, транспортировки, хранения, утилизации отходов, необходимость применения дорогостояще­го оборудования и др.) привели к вытеснению методов, основанных на ра­диоактивной метке, альтернативными.

studfiles.net

Методы иммуноанализа

Примерная методика окрашивания клеток в иммунофлуоресцентном тесте

1. Лимфоциты выделяют из гепаринизированной венозной крови центрифугированием на градиенте фиколл - верографина (урографина) (плотность 1,077 г/мл) (Boyum, 1968);

2. Лимфоциты в концентрации 2 млн на 1 мл в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют по 5 мкл раствора тестируемого моноклонального антитела и инкубируют 30-45 мин. при +4 оС;

3. Добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин. при 200 g;

4. Удаляют супернатант. Затем вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин. при 200 g;

5. Удаляют супернатант. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100. Для разведения используют физиологический раствор, забуференный фосфатами (PBS), содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия (вместо PBS можно использовать раствор Хенкса). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4 оС;

6. Клетки 2 раза отмывают, как указано в пп. 3-4;

7. Клетки готовы для наблюдения иммунофлуоресценции, но если результаты теста будут учитываться лишь через несколько часов, то клетки необходимо зафиксировать. Для этого после заключительного центрифугирования и удаления супернатанта к осадку клеток добавляют 50 мкл 1% параформальдегида на PBS (можно использовать раствор формалина разведенный 1:40 на PBS). Клетки суспендируют. Фиксированные клетки сохраняют флуоресценцию в течение недели.

Окрашенные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре или просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа. В последнем случае клетки суспендируют, суспензия переносится на предметное стекло, накрывается покровным стеклом, и препарат просматривается под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив х90). Наилучшее качество изображения достигается при использовании окуляров с небольшим увеличением (х3 или даже х1,7). Рекомендуется использовать нефлуоресцирующее иммерсионное масло. Наблюдение следует проводить в затемненном помещении. Количество антиген-позитивных клеток определяют как % флуооресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши.

В настоящее время любые молекулы, обладающие антигенными свойствами и присутствующие в исследуемом материале даже в чрезвычайно низких концентрациях, можно выявлять количественно с помощью методов иммунного анализа: радиоиммунного анализа (РИА) и иммуноферментного анализа (ИФА). Приборы для иммунного анализа могут не только «увидеть», но и измерить количество метки, заранее конъюгированной или с антигеном, или с антителом. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях может зарегистрировать прибор, либо увидеть глаз человека. К ним относятся:

· радионуклиды, в этом случае анализ называютрадиоиммунным (РИА);

· ферменты, катализирующие превращение субстрата с образованием цветного или флуоресцирующего продукта. Такие анализы называют иммуноферментными (ИФА) или, как разновидность, иммунофлуоресцентными;

· флуоресцирующие или люминесцирующие вещества и др.

Первые методы иммуноанализа были разработаны в гомогенных вариантах, без разделения компонентов, т.е. в растворе. Но вскоре стали использовать твердую фазу, анализы стали называть твердофазными – с разделением компонентов, или иммуносорбентными (ферментный иммуносорбентный анализ ELISA, от англ. – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). В настоящее время на практике применяют только твердофазные варианты методик ИФА .

Метод радиоиммунного анализа (РИА) был разработан в начале 70-х годов прошлого столетия. За разработку РИА Розалин Ялоу была удостоена Нобелевской премии. Методы радиоиммунного анализа особенно важны для точного количественного определения низких концентраций (нанограммовые, а иногда пикограммовые количества) самых различных соединений, содержащихся в жидкой среде, в том числе антител, антигенов, цитокинов, растворимых форм рецепторов, белковых и стероидных гормонов и др. Эти методы широко применяются при изучении вирусных антигенов, противовирусных антител, в диагностике аутоиммунных заболеваний, а также для определения циркулирующих иммунных комплексов.

РИА основан на феномене конкуренции определяемого (немеченого) антигена с известным количеством меченого антигена (антиген метят изотопами 131I, 3H) за ограниченное количество специфических к антигену антител, введенных в систему (рис. 53). Чем больше в исследуемой жидкости содержится определяемого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами и, следовательно, больше останется в растворе.

Рисунок 53. Метод конкурентного радиоиммунного анализа

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен менее чем через год после описания РИА тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотрудниками в США. Этот метод основан на том же принципе, что и РИА, но вместо радиоактивной метки используется ферментная (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозидаза). Количество меченых антител или антигенов, вступивших в реакцию, определяют на основании изменения окраски субстрата под влиянием фермента. Для считывания результатов ИФА используются автоматические ИФА-ридеры (от англ. read – читать).

С помощью тест-систем ИФА, содержащих поликлональные и особенно моноклональные антитела можно определять общие и специфические иммуноглобулины А, М, G, E, гормоны (как белковой, так и стероидной природы), цитокины, белки сыворотки (в том числе индивидуальные компоненты и фрагменты комплемента и ЦИК), микроорганизмы (вирусы, простейшие, анаэробы и др.), гельминты и многие высокомолекулярные биологические соединения.

В настоящее время ИФА является одним из наиболее часто используемых иммунохимических методов, широко применяемых как в научных, так и в диагностических целях. Например, иммуноферментное определение цитокинов является преимущественным методом по сравнению с другими методами их определения, так как обладает высокой чувствительностью, специфичностью, независимостью от наличия антагонистов и поддается точному автоматизированному учету и стандартизации.

Принцип ИФА заключается в последовательном проведении следующих этапов:

· Сорбция антигена на твердую фазу (например, в лунки полистиролового ИФА-планшета) для выявления антител к нему (либо в сорбции на твердую фазу антител для выявления специфического антигена).

· Внесение в систему (в лунки планшата для ИФА) биопроб, содержащих специфические антитела (или антигены).

· Инкубация смеси в течение определенного времени, в ходе которого происходит специфическое взаимодействие антитела и антигена на твердой фазе; невзаимодействующие компоненты удаляются в процессе отмывания.

· Внесение в смесь фермента (чаще всего пероксидазы), молекулы которого коньюгированы с антивидовыми антииммуноглобулинами (например, кроличьими или козьими антителами к IgG, IgM, IgA человека) и инкубации системы в течение определенного времени.

· Внесение в смесь хромогенного субстрата, каталитически разлагающегося под действием конъюгата фермента с антивидовыми антителами и превращающегося в окрашенное соединение.

· Регистрирация окрашенного продукта, который выявляется визуально, либо спектрофотометрически: интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству специфических антител в биопробе (рис. 54).

Существует ряд вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое применение получил гетерогенный твердофазный ИФА.

Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и легкости удаления соединений, не участвующих в реакции с помощью простого отмывания. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются высокая воспроизводимость количественных характеристик сорбции компонентов (антигены, антитела), используемых в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является физическая адсорбция, при которой соответствующие молекулы присоединяются к поверхности твердой фазы за счет ионных и гидрофобных взаимодействий и водородных связей. Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа.

Рисунок 54. Твердофазный метод ИФА (справа – определение антител в сыворотке, слева – определение антигена в сыворотке)

Постановка. В лунки стрипов вносят по 100 мкл активирующего раствора и инкубируют 30 мин при температуре 370 С. Стрипы во время инкубации помещают в пластиковый пакет. После инкубации содержимое лунок сливают, лунки промывают 3 раза рабочим буферным раствором. В нижние лунки первых двух стрипов вносят по 100 мкл калибровочной пробы, в остальные лунки вносят разведенные образцы анализируемых сывороток по 100 мкл и инкубируют в течение 45 мин при 370С. Затем содержимое лунок удаляют энергичным вытряхиванием и лунки немедленно промывают рабочим буферным раствором 3 раза. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата, стрипы закрывают и инкубируют в течение 30 мин при 370С. После этого содержимое лунок удаляют вытряхиванием, промывают 3 раза рабочим буферным раствором и осушают. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ОФД, приготовленного непосредственно перед использованием. Стрипы накрывают крышкой и выдерживают при 22±40С вдали от яркого света 25-30 минут. Добавляют по 50 мкл стоп-реагента во все лунки стрипов. Результаты анализа регистрируют фотометрически при длине волны 492 нм. Концентрации иммуноглобулинов в исследуемых образцах определяют, нанося полученные значения оптической плотности на калибровочный график.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами выявления антигенов и антител обладает важными преимуществами:

· высокой чувствительностью (существуют варианты ИФА, позволяющие выявлять антитела или антигены в концентрации до нескольких пг/мл);

· возможностью использовать минимум исследуемого материала (например, для проведения всех анализов группы ELISA будет достаточно 0,5 мл сыворотки обследуемого);

· стабильностью реагентов, используемых в работе;

· возможностью автоматизации.

Все эти достоинства определили широкое применение ИФА практически во всех областях современной медицины.

Page 2

Для лимфоцитов наиболее характерным ответом на встречу с митогенами и антигенами, к которым они специфичны, является пролиферация, связанная с активным синтезом в них ДНК. Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены и митогены является тестом, позволяющим оценить функциональную полноценность этих клеток.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ).Стимуляция лимфоцитов в реакции бласттрансформации основана на свойстве лимфоцитов в результате контакта с митогенами и антигенами превращаться в лимфобласты – клетки, готовящиеся к делению и активно синтезирующие ДНК.

При постановке РБТЛ применяются три группы стимуляторов:

1) аллогенные лимфоциты, то есть лимфоциты другого человека. Данная реакция используется, в основном, при подборе доноров для трансплантации;

2) антигенная стимуляция, когда используется антиген, сенсибилизация к которому должна быть определена;

3) Т-митогены, получаемые из растений (фитогемагглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса), и В-митогены (декстран сульфат, бактериальные липополисахариды).

В клинико-иммунологических лабораториях используются, в основном, стимуляторы третьей группы, чаще всего – фитогемагглютинин (ФГА). Конечный результат в реакции бласттрансформации лимфоцитов оценивают двумя способами. Первый основан на морфологическом анализе, когда производится подсчет количества клеток, подвергшихся бласттрансформации, под микроскопом. Метод более прост, но трудоемок и дает значительный разброс результатов вследствие технических и субъективных ошибок.

В основе второго способа лежит радиометрическое измерение (рис. 55).

Рисунок 55. Реакция бластной трансформации лимфоцитов

Добавляя в культуру лимфоцитов меченный изотопом Н3-тимидин, необходимый для синтеза ДНК, с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика измеряют количество включенного клетками изотопа, причем одновременно проводят определение радиоактивности в параллельной культуре, в которую митоген не добавляли. Количество импульсов, регистрируемое автоматическим счетчиком, прямо пропорционально активности пролиферативного ответа лимфоцитов на стандартный митоген. Отношение величины включения Н3-тимидина в культурах без стимуляции к величине включения в стимулированных культурах отражает выраженность бласттрансформации. В норме индекс стимуляции для Т-лимфоцитов равен 10-20.

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ).РТМЛ успешно применяют при изучении иммунного ответа при различных инфекционных заболеваниях, особенно обусловленных внутриклеточным паразитированием бактерий: туберкулез, бруцеллез, лепра; при кандидозах и хронических вирусных инфекциях; а также для установления сенсибилизации к аллергенам при аллергических заболеваниях (при изучении гиперчувствительности замедленного типа). Эту реакцию также применяют для определения степени гистосовместимости при трансплантации и оценки течения опухолевых процессов.

Принципметода заключается в том, что лимфоциты иммунного донора при контакте со специфическим антигеном, к которому они сенсибилизированы, in vitro образуют и выделяют в культуральную среду факторы торможения миграции, угнетающие миграцию моноцитов/макрофагов. С помощью этой реакции можно в определенной степени оценить способность Т-лимфоцитов к синтезу цитокинов –медиаторов Т-клеточного иммунитета. У неиммунных доноров способность Т-лимфоцитов к синтезу факторов торможения миграции можно исследовать, используя вместо специфического антигена Т-митогены (ФГА, Кон-А).

Постановка метода. Смесь лейкоцитов, полученных из плазмы крови без примеси эритроцитов, смешивают в равных объемах (50 мкл) со средой 199 (в контроле) и с ФГА - индуцированный вариант. Концентрация ФГА составляет 10 мкг в 1 мл.

Существует несколько модификаций данной реакции. В планшет для иммунологических реакций, в дуплете или триплете, разливают среду 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей активированной сыворотки. Капилляры размером 7мм и диаметром 1 мм заполняют смесью лейкоцитов со средой или ФГА. Один конец запаивают смесью воска с парафином в соотношении 1:3, другой – опускают в ячейку планшета. Планшет закрывают крышкой, помещают на инкубацию при 37оC на 18-24 часа.

После удаления капилляров жидкость в лунках ресуспендируют. Подсчитывают с помощью камеры Горяева количество лейкоцитов в каждой лунке. Высчитывают среднее значение для контроля и для пробы с ФГА. Для вычисления индекса миграции концентрацию клеток в опыте делят на таковую в контроле. В норме соотношение равно 0,6-0,87.

Page 3

Лабораторная оценка нарушений врожденного иммунитета

Функциональная оценка В-лимфоцитов

Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях является одним из наиболее важных интегральных показателей функциональной полноценности В-лимфоцитов и всей системы регуляции гуморального адаптивного иммунитета.

Традиционно концентрацию сывороточных иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини.В настоящее время этот метод все еще находит свое применение, предпочтение отдается моноклональным антителам против отдельных антигенных детерминант (эпитопов), характерных для отдельных классов иммуноглобулинов.

Принцип метода Манчинизаключается в том, что образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агара, в которых содержатся антитела против IgM, IgG, IgA в стандартной концентрации. Иммуноглобулины, содержащиеся в исследуемой сыворотке, диффундируют в агар и при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Окончательный размер кольца преципитации зависит от концентрации соответствующих иммуноглобулинов. Метод Манчини позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов, равную 10 мкг/мл. Ошибка метода составляет 10%.

Для диагностики нарушений врожденного иммунитета обычно определяют фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и оценивают состояние системы комплемента.

Наиболее информативными для оценки фагоцитарной системы следует считать фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила).

Фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий или частиц латекса, поглощенных в расчете на один нейтрофил.

Также проводятсятесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение).

При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 370 С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов, поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия –НСТ-тест позволяет оценить метаболическую активность гранулоцитов крови, выявляет резервные возможности внутриклеточных систем фагоцитов. НСТ-тест основан на восстановлении поглощенного лейкоцитами крови растворимого красителя – нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан черного цвета (внутриядерные включения – глыбки диформазана) под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцитоза.

Постановка реакции. На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия).

В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий E. coli или раствор пирогенала (липополисахарид S. typhi ) в разведении 1:10. На другое обезжиренное стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 минут. Готовят мазки, высушивают, фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая процент лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета).

Page 4

Определение содержания компонентов и ингибиторов системы комплемента проводится, главным образом, при подозрении на генетически обусловленные дефекты этой системы. Однако в последнее время эти тесты находят все более широкое применение и для оценки характера течения и эффективности терапии иммунокомплексных заболеваний.

Раньше состояние системы комплемента оценивали, главным образом, с использованием громоздкой гемолитической системы, для чего использовали концентрации сывороток крови, которые вызывают 50%-100% гемолиз в гемолитической системе, что позволяло получить суммарное представление об активности системы комплемента. В настоящее время определение индивидуальных факторов системы комплемента чаще проводится методом ИФА с помощью моноклональных антител.

Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов. Экзогенные и эндогенные антигены могут образовывать в организме человека иммунные комплексы с соответствующими антителами, что может стать причиной системной или органной патологии. Иммунные комплексы образуются при реакции антител (чаще всего класса IgM или IgG) с антигенами. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) имеют обычно три составные части: антиген, антитело и связавшийся с ними комплемент (рис. 56). Образование иммунных комплексов в организме является физиологической реакцией иммунитета, при которой активизируются механизмы, предназначенные для нейтрализации и удаления антигенов из кровеносного русла или из тканей.

Если концентрация иммунных комплексов не превышает допустимых пределов, организм способен эффективно их ликвидировать, при этом не возникает никакого вреда. В противном случае, в частности, при системных аутоиммунных, инфекционных заболеваниях, аллергии, а также при злокачественных новообразованиях ЦИК оседают в некоторых тканях и органах, образуя депозиты и вызывая за счет активации комплемента воспалительно-деструктивный процесс.

При физиологических условиях скорость образования иммунных комплексов относительно мала по сравнению со способностью организма к их элиминации. Поэтому в норме уровень ЦИК в сыворотке крови является достаточно низким (до 55 у.е.). В крови иммунные комплексы могут быть связаны с эритроцитами, а также присутствуют в свободной форме в плазме (ЦИК). Связанные с эритроцитами комплексы реже оказывают повреждающее действие, поэтому больший интерес представляет определение уровня свободных ЦИК.

ЦИК, содержащиеся в сыворотке крови, осаждаются центрифугированием, а затем проводят спектрофотометрию на 450 нм для определения концентрации белка (она соответствует концентрации ЦИК).

Рисунок 56. Определение циркулирующих иммунных комплексов

Page 5

Постановка метода. При отборе проб крови необходимо соблюдать ряд предосторожностей, поскольку связанные иммунные комплексы при образовании сгустка легко высвобождаются под действием фактора I. Чтобы избежать этого, следует быстро отделять эритроциты от плазмы.

Для идентификации средних и крупных комплексов, содержащих антитела IgG, часто используют осаждение иммунных комплексов раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000) в 0,1м натрий-боратном буфере pH 8,4 с последующим определением IgG в осадке. Рабочую смесь готовят из расчета 100 мкл сыворотки крови больного и 200 мкл буфера. К 0,9 мл раствора ПЭГ добавляют 100 мкл рабочей смеси, в пробирку контроля к 100 мкл рабочей смеси добавляют 0,9 буфера. Обе пробирки выдерживают 1 час при комнатной температуре с последующей спектрофотометрией на СФ 26 при длине волны 450 нм. Количество ЦИК определяют по разнице оптической плотности по сравнению с контролем и выражают в условных единицах. На этом принципе основан ряд коммерческих систем определения иммунных комплексов.

Определение содержания цитокинов в сыворотке крови

Важной функцией моноцитов и лимфоцитов крови являются продукция и секреция цитокинов. Цитокины – это регуляторные белки иммунной системы, играющие критическую роль в межклеточных коммуникациях и опосредующие ряд биологических функций, таких как рост и дифференцировка клеток в гемопоэзе, эффекторные и регуляторные функции иммунокомпетентных клеток.

На сегодняшний день наиболее оптимальными для оценки уровней цитокинов являются иммуноферментные методы. Применение диагностических иммуноферментных тест-систем для оценки цитокинового статуса как на местном, так и на системном уровнях при различных патологиях является существенным, позволяя углубить понимание патогенеза заболеваний. Оценка способности лимфоцитов и моноцитов крови продуцировать цитокины (интерлейкины, интерфероны) в последнее время все чаще используется для проверки их функциональной полноценности.

IL-2. Содержание в культуральных жидкостях и сыворотке крови определяется в интервале концентраций от 20 до 1000 пг/мл (1пг=10-12г). IL-2 представляет собой гликопротеин, синтезируемый Т-лимфоцитами при активации митогенами или антигенами. IL-2 играет ключевую роль в развитии иммунного ответа. Низкий уровень IL-2 наблюдается при целом ряде заболеваний: злокачественных опухолях, рассеянном склерозе, склеродермии, ревматоидных артритах, инсулинозависимом диабете, СКВ и др.

IL-1-bопределяется в образцах сыворотки и культуральных жидкостях в диапазоне концентраций от 6,3 до 400 пкг/мл. Основными источниками IL-1b являются моноциты, макрофаги и дендритные клетки. В отличие от IL-1a, IL-1b представлен в виде растворимой формы. Благодаря выраженным иммуномодулирующим свойствам рекомбинантная форма IL-1b применяется в клинической практике для лечения иммунодефицитов и восстановления гемопоэза.

RAIL-1(рецепторный антагонист IL-1). Содержание в сыворотке здоровых доноров варьирует от 350 до 700 пг/мл. Продуцируется макрофагами, моноцитами, нейтрофилами, фибробластами и эпителиальными клетками. RAIL-1 подавляет биологическую активность IL-1a и IL-1b, конкурируя с ними за связывание с рецепторами. Определение концентрации RAIL-1 в крови человека может иметь диагностическое и прогностическое значение при сепсисе, ревматоидном артрите, астме и воспалительных заболеваниях.

IL-4 продуцируется активированными Т-лимфоцитами. IL-4 стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов, костномозговых клеток - предшественников и тучных клеток. IL-4 вызывает экспрессию ряда поверхностных антигенов и стимулирует продукцию цитофильных иммуноглобулинов. Его многочисленные биологические функции включают индукцию переключения продукции иммуноглобулинов плазматическими клетками на продукцию IgE и стимуляцию субпопуляции Т-хелперов – Th3, которые регулируют гуморальный иммунный ответ. IL-4 также обладает выраженной противоопухолевой активностью.

IL-8 продуцируется мононуклеарными фагоцитами, полиморфноядерными лейкоцитами, эндотелиальными клетками и разнообразными мезотелиальными типами клеток в ответ на различные стимулы, включая эндотоксин, IL-1, TNF-a и вирусы. Первичная функция IL-8 - активация и хемотаксис нейтрофилов к месту воспаления. В настоящее время проходят испытания препаратов для лечения ран на основе IL-8.

IFN-αявляется одним из ключевых элементов неспецифической защиты организма от вирусных инфекций. IFN-αсинтезируется клетками моноцитарно-макрофагального ряда. Практически все типы клеток при должной стимуляции могут стать продуцентами IFN-a, однако максимальные количества IFN-a продуцируют предшественники дендритных клеток. В норме уровень альфа-интерферона в сыворотке крови незначителен и составляет всего несколько единиц: 5-50 пкг на 1 мл сыворотки. Основными индукторами синтеза IFN-a являются большинство вирусов и их продуктов, среди которых ведущее место занимает двухцепочечная РНК. Биологические функции IFN-a направлены на подавление вирусной инфекции и опухолевого роста. Препараты на основе IFN-a активно используются в клинической практике.

IFN-gпродуцируется Т-лимфоцитами и натуральными киллерами. Стимулирует in vitro и in vivo антимикробную и противоопухолевую активность макрофагов, а также натуральных киллеров. IFN-g стимулирует экспрессию молекул МНС класса II, является кофактором дифференцировки и активации В-клеток и функциональным антагонистом IL-4.

TNF-a. Макрофаги выступают основными продуцентами TNF-a в ответ на многочисленные стимулы: митогены, цитокины, бактерии, вирусы и паразиты. Несмотря на противоопухолевую активность, TNF-a играет большую роль в модуляции иммунного ответа, воспаления и гемопоэза; участвует в противоопухолевом иммунитете, а при избыточной продукции вызывает анорексию, кахексию и септический шок.

Page 6

Кожно-аллергические пробы

Диагностика аллергических заболеваний

Для диагностики аллергических заболеваний используют следующие лабораторные методы.

Проводят внутрикожные пробы с подозреваемыми аллергенами с учетом реакции через 15-30 минут.

Здоровому добровольцу внутрикожно вводят сыворотку больного. Через 12-24 часа в это же место вводят подозреваемый аллерген. Реакцию учитывают через 15-30 минут. IgE, содержащийся в сыворотке больного, прикрепляется к Fc-рецептором тучных клеток кожи добровольца. При введении сюда же аллергена последний связывается с Fab-фрагментами IgE, что приводит к дегрануляции тучных клеток и возникновению воспалительной реакции.

Иммунофлуоресцентный анализ используют для оценки уровня общего IgE и определения уровня специфического IgE.

Принцип метода. Исследуемый аллерген связывается с твердой фазой (бумажный диск, активированный полимер и др.) При добавлении сыворотки больного происходит связывание аллергена, фиксированного на твердой фазе, с антителом, если в сыворотке присутствуют соответствующие данному аллергену антитела. После отмывания несвязавшихся IgE добавляют антитела против IgE, меченные флуорохромом. Происходит образование комплекса: аллерген, IgE и антитела против IgE. Несвязавшиеся антитела удаляются. Уровень связавщегося специфического IgE определяется по интенсивности свечения.

Метод Шелли (прямой и непрямой) используют для определения аллергенспецифического IgE, фиксированного на тучных клетках и базофилах и вызывающего их дегрануляцию.

Принцип непрямого метода основан на изучении морфологических изменений тучных клеток и базофилов лабораторных животных в результате взаимодействия с сывороткой больного и специфическим аллергеном. IgE, содержащийся в сыворотке, фиксируется на Fc-рецепторах тучных клеток и базофилов. Затем добавляемый аллерген связывается с Fab-фрагментами молекул IgE, фиксированных на клетках, что вызывает их дегрануляцию. Краситель нейтральный красный избирательно окрашивает гранулы базофилов в кирпично-красный цвет, что позволяет их отличать от других клеток. Реакцию наблюдают под микроскопом с иммерсионной системой. Неизмененные базофилы имеют округлую форму, гранулы, окрашенные краской, располагаются внутри клетки. Положительная реакция проявляется в деформации клеток, образовании псевдоподий, усиленном движении гранул и в редких случаях – выходом гранул из клетки с разрывом ее. В каждом препарате насчитывают 40 базофилов, вычисляют процент морфологически измененных клеток в опыте и в контроле.

Прямой тест основан на изучении морфологических изменений базофилов периферической крови пациента с аллергическими заболеваниями при взаимодействии со специфическим аллергеном. Оценивается реакция аналогично оценке при непрямом тесте.

Большой популярностью пользуется определение показателя повреждения нейтрофилов –тест ППН по В.А. Фрадкину (1985). ППН используется при десятках различных заболеваний: многих инфекционных, аутоиммунных, аллергических как I, так и II и III типов.

Данный тест выявляет циркулирующие или фиксированные на нейтрофилах антитела или иммунные комплексы: благодаря наличию на нейтрофилах рецепторов для Fc-фрагмента IgG и для С3 при соединении антигена с антителом и фиксации комплемента происходит активизация нейтрофилов, осуществляющих фагоцитоз иммунных комплексов. В соответствии с этим наиболее высокие показатели ППН отмечены при III типе гиперчувствительности - иммунокомплексном.

Принцип проведения теста ППН. В разные лунки вносят определенный объем готовых заводских аллергенов (в разведении 1:100), одна лунка служит контролем (физиологический раствор). Лейкоциты лейкоконцентратов обследуемого пациента нагружают различными аллергенами. Плашку с лунками помещают в термостат. После инкубации в каждую лунку добавляют по 1 капле 0,1% раствора акридинового оранжевого. Содержимое каждой лунки переносят на обезжиренные предметные стекла, последовательно пронумеровав их. Покрыв покровным стеклом, в герметичной влажной камере помещают приготовленные микропрепараты в холодильник на 16-18 часов. Подсчет клеток ведется методом непрямой иммунофлуоресценции в темном поле: подсчитываются количество поврежденных нейтрофилов, что выражается в процентном соотношении к количеству неизмененных клеток. В том случае, когда степень повреждения клеток в контроле (т.е. с физ. р-ром) высокая (от 16 % и выше), имеет место неспецифическая нестабильность мембран нейтрофилов, что, несомненно, повлияет на тактику лечения. Интерпретацию анализа, как правило, ведут врачи- аллергологи.

Page 7

В развитии и становлении иммунной системы у детей существуют так называемые критические периоды. В общем плане эти периоды характеризуются как физиологические иммунодефициты, или физиологическая иммунокомпроментация. Критические периоды характеризуются наибольшей ранимостью и чувствительностью иммунной системы к внешним воздействиям, хотя еще внутриутробно критическое состояние для иммунной системы наступает в возрасте плода 8-12 недель, когда происходит дифференцировка органов и клеток адаптивной иммунной системы.

Первый критический период формирования адаптивной иммунной системы после рождения (период новорожденности) длится до 30 дней жизни, когда организм ребенка встречается с огромным количеством антигенов. Отмечается функциональный дисбаланс Т- и В-лимфоцитов, синтезируется и секретируется только IgM. В силу функциональной слабости фагоцитов снижен процессинг антигенов. Для этого периода характерны низкая резистентность организма по отношению к условно-патогенной, грамотрицательной флоре, вирусам герпеса, цитомегаловирусам. Отмечается склонность к генерализации воспалительных процессов (септические состояния).

Второй критический период соответствует 3-6 месяцам жизни ребенка. Этот период характеризуется ослаблением пассивного гуморального иммунитета новорожденных за счет распада материнских антител. На большинство антигенов индуцируется первичный иммунный ответ с преимущественным синтезом IgM. Дети чувствительны к вирусам парагриппа, аденовирусам (пневмонии, бронхиолиты). Проявляются многие наследственные иммунодефициты.

Третий критический период приходится на второй-третий годы жизни ребенка. На большинство антигенов синтез IgM уже переключается на образование IgG. В этот период отлаживается синтез подклассов IgG1 и IgG3. Для этого периода характерны проявления иммунокомплексных и аутоиммунных заболеваний. Дети склонны к повторным вирусным и микробно-воспалительным заболеваниям.

Четвертый период – 4-7-й годы жизни. В этом возрасте отмечается второй перекрест в содержании форменных элементов крови. Уровень IgM и IgG соответствует показателям взрослых, а уровень сывороточного IgA еще не достигает окончательных значений, содержание IgE в крови достигает максимальных величин. В этом возрасте у детей наблюдаются высокая частота атопических, паразитарных и иммунокомплексных заболеваний. Формируются многие хронические заболевания.

Пятый критический период – подростковый возраст (12-13 лет у девочек; 14-15 лет – у мальчиков). Повышение секреции половых гормонов ведет к подавлению Т-клеточного звена адаптивного иммунитета. Отмечается новый подъем хронических воспалительных, аутоиммунных и вирусных заболеваний.

Иммунный статус детей имеет свои особенности. Состояние иммунной системы ребенка в первые годы жизни характеризуется высокой динамичностью. В момент рождения у ребенка наблюдается физиологический лейкоцитоз – 12-15х109/л. На 5-е сутки жизни происходит первый «перекрест» в формуле крови - нейтрофилез сменяется абсолютным и относительным лимфоцитозом - подготавливается база для последующего достаточно длительного обучения и специализации большого множества клонов Т-и В-лимфоцитов.

В возрасте 5-6 лет вместе с созреванием адаптивной иммунной системы отмечается второй «перекрест» в содержании форменных элементов крови – снижение удельного веса лимфоцитов и повышение числа нейтрофилов.

У детей младшего возраста относительное и абсолютное количество лимфоцитов в крови почти вдвое выше, чем у взрослых. Так, относительное содержание лимфоцитов в процентах к общему числу лейкоцитов составляет 63-69%, а абсолютное – 1,75-3,09х109/л. В возрасте 12-14 лет количество лимфоцитов у детей приближается к их числу у взрослых и далее меняется незначительно.

Из общего числа лимфоцитов около половины составляют Т-клетки. Относительное количество Т-лимфоцитов (CD3+) в пуповинной крови у новорожденного снижено примерно в 1,5 раза, но уже к концу первого месяца число Т-лимфоцитов возрастает. В абсолютных величинах количество Т-лимфоцитов у новорожденных, учитывая высокий лейкоцитоз, не изменено.

Количество CD4+ Т-лимфоцитов и CD8+ Т-лимфоцитов у детей до шести лет составляет соответственно 30-40% и 25-32% от общего количества лимфоцитов, а абсолютное количество - 1,02-1,84х109/л и 0,81-1,52х109/л. В возрасте 12-14 лет эти показатели достигают значений, характерных для взрослых.

Содержание В-лимфоцитов (CD20+) в крови новорожденных превышает в 4-5 раз количества, определяемые у взрослых. Так, абсолютное содержание В-лимфоцитов составляет 0,74-1,33х109/л. Однако функциональная активность их резко снижена, они не отвечают на В-клеточные митогены пролиферацией.

У новорожденного ребенка доминирует пассивный иммунитет за счет материнского IgG, хотя уже на 1-м месяце жизни отмечается начало синтеза собственных антител. В пуповинной крови новорожденных определяются иммуноглобулины классов IgM и IgG, IgА; IgЕ обнаруживается крайне редко. В первые два года жизни ребенка содержание в крови IgM и IgG существенно возрастает, после чего изменяется незначительно.

Уровень IgM у новорожденных детей в сыворотке крови обычно составляет около 10% (0,43 г/л) от уровня взрослых. Через 1-3 месяца он увеличивается до 60-65%, а в возрасте 1-2 лет нередко уже достигает уровня взрослого человека (1,08-1,2 г/л). Однако в этом возрасте возможны его значительные колебания. У подавляющего же большинства здоровых детей уровень общего IgM стабилизируется и в возрасте 6-9 лет становится равным уровню взрослых.

У новорожденных детей в сыворотке крови уровень IgG (за счет иммуноглобулинов материнского происхождения) часто такой же, как у взрослых, однако уже через 2-4 месяца он уменьшается до 30-40% (5,0-7,5 г/л) от исходного. Затем он медленно увеличивается, достигая к 6 месяцам 45 %; к 8-10 месяцам – 62 %; к 6 годам – 90 % (10,8-11,0 г/л); и только в 9-12 лет он, наконец, становится равным (5,4-16,1 г/л) – уровню взрослого человека. Значительное отклонение уровня IgG от нормы отражает измененное состояние иммунной системы и может свидетельствовать о серьезном заболевании.

Сывороточный IgA в крови новорожденных, как правило, отсутствует в течение первого месяца жизни. В дальнейшем его содержание медленно нарастает, составляя к концу первого года около 1% (0,06 г/л) от уровня этого белка у взрослых. В возрасте 1-3 месяцев он обычно достигает 14 %; 4-5 месяцев – 28 %; 8-24 месяцев – 40 %, 6 лет – 65 % (1,16-1,25 г/л); 9 лет – 75 % (1,45-1,56 г/л); 12-13 лет – 90-100 % (0,9-4,5 г/л) от уровня взрослого человека (15-45 лет).

Секреторный IgA является важным фактором местного иммунитета. Секреторный IgA и секреторный компонент SC полностью отсутствуют у новорожденных и начинают обнаруживаться в секретах после 3-го месяца жизни, что позволяет говорить о недостаточности местного иммунитета у детей раннего возраста. Однако при грудном вскармливании новорожденные получают с грудным молоком материнские секреторные IgA, которые способны усиливать местную защиту слизистых против многих микроорганизмов. Формирование полноценного местного иммунитета у детей, как правило, завершается к 10-12 годам.

Активный синтез IgE начинается в раннем грудном возрасте. Нормальный уровень суммарного IgE в сыворотке крови у детей до одного года обычно не превышает 3,5-4,0 МЕ/мл. К 4-7 годам содержание IgE у детей достигает максимальных значений.

studopedia.su


Смотрите также

Календарь

ПНВТСРЧТПТСБВС
     12
3456789
10111213141516
17181920212223
24252627282930
31      

Мы в Соцсетях

 

vklog square facebook 512 twitter icon Livejournal icon
square linkedin 512 20150213095025Одноклассники Blogger.svg rfgoogle